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当“无细胞合成”遇上“INSPECTR”：体外诊断（IVD）带入家用即时检测领域

2023-07-14

今天和大家分享一篇今年5月发表在Nat Biomed Eng.（IF=29.234）杂志上的文章，标题为“在环境温度下通过DNA探针靶标夹板连接产生的报告蛋白检测病毒RNA”。

值得关注的是该篇文章的主要作者及通讯作者单位为Sherlock Biosciences，无细胞蛋白表达是该公司主要平台之一。同时，就职于MIT和哈佛的James J. Collins教授也参与了该项研究。文中提到的 INSPECTR是一种基于合成生物学可以不依赖任何仪器的bio-sensor解决方案，其原理是检测到目标后，即可释放预先设计的蛋白核酸序列，并通过无细胞系统进行转录翻译合成报告蛋白，然后可通过肉眼检测到。其技术来自于Wyss Institute的授权， James J. Collins博士正是Wyss的核心创始人之一。

研究背景

在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的全球大流行的影响下，病毒检测的方法尤为重要，需要更加迅速、准确地确定患者，及时地隔离和治疗患者。然而，传统的核酸检测过程需要严格控制反应温度，还需要昂贵而复杂的设备，这使得其应用范围受到一定的限制。因此，快速、简易、准确的新型检测技术已经引起了生物医学领域的广泛关注。

本研究在这种背景下，该研究团队报道了一种在环境温度下对核酸进行精确和多重检测的无仪器测定方法，并命名为INSPECTR（用于内部“夹板”配对表达盒翻译反应），该表达盒可以灵活设计用于报告蛋白的无细胞合成，不仅可以检测新型冠状病毒，还可以在更广泛的病毒感染检测领域中使用。同时，可以减少检测时间和实验室成本。总的来说，这种基于合成生物学的方法可简化病毒检测流程，并有望扩大其在护理领域的应用。

结果

1、INSPECTR工作流程

INSPECTR工作流程的概述如图1所示，单链DNA探针经过设计，在特定靶向RNA上具备同源性，只有当RNA“扣夹”三元分子结构时，才能进行连接反应。连接后的探针可以作为DNA聚合酶双链合成的模板。双链线性产物编码了完整的报告基因表达组件，包括T7启动子、核糖体结合位点（RBS）、报告蛋白以及T7终止子。当其添加到无细胞表达系统中时，经过转录和翻译会产生模块化的报告产物，可以通过电子或视觉进行观测。整个INSPECTR工作流程可在环境温度下进行，不需要核酸预扩增。此外，这种设计策略将序列输入从表达输出中解耦，创造了将广泛的报告蛋白与任何靶核酸进行配对的灵活性。

图1：1.INSPECTR工作流程

2、使用发光INSPECTR输出进行RNA检测

通过模拟预连接dsDNA的实验，我们发现，由于纳米荧光素酶（nLuc）尺寸小且亮度高，可能会是INSPECTR有效的报告荧光（图2）。因此，本研究设计了一种发光探针来检测SARS-CoV-2 RNA基因组。为确保探针可以有效识别目标RNA序列，研究团队采用了四个30nt的DNA序列来组装“连接”探针，以保护病毒基因组，同时不影响翻译酶的表达或功能，成功构建了用于检测RNA序列的分裂ssDNA探针，并确认了一个仅在靶标存在时具有高信号的探针组。在工作流程中，连接的探针可以在环境温度下的反应过程中形成双链结构，并可以可靠地检测检测到1fM的短合成靶RNA和10fM的SARS-CoV-2 RNA，对应于连接反应中的约1000个基因组拷贝。此外，我们发现与图2中的“模拟预连接”dsDNA实验相比，“连接表达”工作流程中损失了约1000倍的灵敏度，这可能是由于模板双链的低效率、连接缓冲液对表达反应的毒害以及反应步骤之间的稀释等因素导致的。研究人员未来将进一步优化ssDNA探针结构或连接酶工程，以提高测定的灵敏度。

图2：模拟预连接dsDNA实验

图3：INSPECTR发光输出对RNA进行线性定量检测

3、使用双表位肽报告子的多重RNA检测

研究人员通过开发一种通用的报告子检测策略，成功地将INSPECTR开发成一种无需仪器的快速抗原检测工具，并将检测灵敏度提高了100倍。该策略使用了一个三明治免疫测定策略来利用两种分析物结合事件所产生的特异性，寻找可以侧流免疫测定法检测的高亲和力抗体和表位对，最终验证了双表位报告子方法的通用性。

INSPECTR技术充分利用了无细胞系统同时表达多种“输出”的固有能力，通过将每个报告肽寻址到唯一的RNA“输入”，实现了多路复用。该技术通过低交叉反应性验证，选择了具有表位特异性活性的抗体来进行空间多路复用的测试条的开发。研究人员还通过优化抗体的剥离顺序和缓冲液组成，使测试条具有更高的灵敏度和特异性。最终，研究人员成功证明了INSPECTR技术的实用性，能够用于针对多种呼吸道病原体的快速检测，并成功地对RNA靶点进行了五重检测且具有较低的测定背景。

图4：代表五种呼吸道病原体的合成RNA靶点的多重检测

4、通过滚圈扩增实现SARS-CoV-2的灵敏检测

该研究中，研究人员通过滚圈扩增（RCA）方法来提高INSPECTR测定的灵敏度。他们重新设计并连接“连接探针”，使得连接后的完整表达盒成为圆形的，并且在连接后、RCA前加入核酸外切酶步骤对减少背景信号至关重要同时加入核酸外切酶步骤对减少背景信号至关重要。他们还将T7启动子移到GFO上，以防止表位编码探针与自身的假连接产生的圆圈的表达。最终，他们成功地将测定的检测极限（LoD）提高到3.5fM（4200个拷贝）靶RNA，并证明了其与完整病毒颗粒裂解工作流程的兼容性。后续通过筛选得到的一种由HCl和洗涤剂LAPAO组成的配方，能够在室温下在不到30秒的时间内完全裂解SARS-CoV-2，而不会影响任何下游过程。

图5：RCA能够灵敏地检测目标

总结

INSPECTR是一种低成本且与无仪器工作流程兼容的可编程分子诊断方法。该方法利用靶向介导的DNA探针连接，形成表达盒，再通过转录和翻译生成报告基因。INSPECTR具有视觉可读出、量化、且具有高灵敏度和多路复用等功能，可以在低成本的生物化学试剂和无细胞表达系统中进行，其应用不仅局限于传染病诊断，还可以用于检测抗微生物肽、单核苷酸多态性等方面。当然，INSPECTR在实现PCR水平的灵敏度和抗原水平的易用性方面仍需进一步努力。

作为CRISPR技术落地的关键领域，分子检测可能是比治疗领域能更快落地的方向。结合合成生物学，减少对仪器设备的依赖，成为POCT甚至所谓Point-of-Need-Diagnostic，想象空间巨大。尤其是在非洲地区，这种电力供应受限、野外条件恶劣的地区，尽量少的仪器投入与及时准确的检测是至关重要的。

作者：杜静

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