又一应用场景！功能性蛋白的无细胞合成！
2023-12-28
前言
今天分享一篇2022年发表于communications biology(IF=5.9)的文章，标题为《无细胞合成的感染性淀粉样原纤维适用于亚毫克级别的磁角旋转核磁共振分析》
研究背景
淀粉样蛋白是一种结构有序的蛋白质聚集体，因其在蛋白质错误折叠疾病中的关键作用而受到广泛关注。淀粉样蛋白纤维结构主要是依靠于固态核磁共振(NMR)的手段，但快速磁角旋转(MAS)和1H检测方法的出现大大扩展了解密淀粉样原纤维结构组织的方法。
天然状态下，MAS核磁共振方法受到限制，需要富集引入核磁共振活性同位素。由于淀粉样蛋白固有的疏水性和聚集成包涵体的倾向，许多淀粉样蛋白在细菌系统中的表达具有挑战性。无细胞(CF)蛋白表达可以替代传统的细菌表达，产生疏水蛋白，引入核磁共振活性同位素，提高核磁共振分析的速度。
本文介绍了CF合成的淀粉样原纤维用于MAS NMR。作者利用CF表达系统在关键位点引入MNR活性同位素/标记。证明了HET-s(218-289)在无细胞表达混合物中直接组装成感染性纤维，不需要变性和纯化程序。通过在氨基酸的关键位置引入定制的13C和15N同位素或CF3和13CH2F标记，证明了无细胞合成的淀粉样原纤维在亚毫克量下容易接受高分辨率MAS NMR。
实验设计
本研究的思路在于实现利用CF合成淀粉样原纤维适用于亚毫克量级下的MAS NMR的目的。通过CF合成系统获得淀粉样原纤维，并在氨基酸关键位点引入NMR活性同位素(13C和15N)/CF3和13CH2F标记，验证其生物学功能，并利用快速的MAS NMR检测其构象，探讨了CF合成系统的优势，以及适用于CF合成系统的MAS NMR的检测方法。
图1：研究思路
研究结果
结果一：CF合成的朊病毒蛋白(HET-s)聚集体表现出与由异源纯化的HET-s相似的形态和感染性
作者通过CF表达系统表达纯化出HET-s聚集体，并检测其特性(图2a-b)。通过电镜对HET-s颗粒进行观察，发现CF合成的HET-s的形态与体外培养产生的HET-s相似(图2c)。对CF合成的HET-s进行感染性测定，发现它成功地诱导了鹅绒P.anserina(图2d)体内HET-s的形成，与体外培养纯化的HET-s有相同的感染行为。
图2：淀粉样蛋白的无细胞合成
结果二：CF合成的淀粉样原纤维折叠成典型的β螺线管结构，可应用于MAS NMR研究
HETs(218-289)(图3a-2b)的淀粉样核心是由两层β链组成的β螺线管折叠，称为重复R1(N226-G242)和R2(N262-G278)。选择加入13C,15N标记的甘氨酸(G)、缬氨酸(V)和异亮氨酸(I)三种氨基酸来对CF合成方案中的核磁共振活性同位素进行标记(图3a)，对得到的产物CF-GVI-HET-s和体外重组表达纯化的样品R-HET-s进行2D hNH实验(图3c)，发现它们G、V和I残基的化学位移一致，表明其构象相似。此外，在CF-GVI-HET-s中观察到一组唯一的共振，表明在残基水平上结构多态性非常低，G、V、I残基没有代谢紊乱。总之，相较于体外重组表达纯化蛋白的程序，CF合成方案更加有优势。
图3：无细胞合成淀粉样原纤维的MAS NMR分析。蓝色：NMR活性同位素标记(G、V、I);黄色：HET-s初级序列
结果三：CF合成的淀粉样原纤维允许关键的13C同位素标记，利用1H检测获得核磁共振结构指纹图谱
接下来，利用MAS 1H检测标记了NMR活性同位素的CF合成淀粉样原纤维(CF-GVI-HET-s)，2D hNH(图3c)和2D hCH(图3d)实验结果显示用亚毫克量记录CF合成淀粉样原纤维具有良好的灵敏性和分辨率。由于13C维度的较高色散，2D hNH(图3d)实验获得了更好的光谱色散。如观察到的15N共振，13C化学位移是独特的，表明CF制备中结构多态性水平很低。图3e显示了选定残留物的1D 1H投影的重叠。通过测量每个残基的酰胺1H线宽，发现CF-GVI-HET-s和R-HET-s的结构相似。由于CF RM是非纯化的，1H核比13C核对结构异质性更敏感，说明CF-合成的淀粉样原纤维的质量更高，适用于更复杂的1H检测MAS NMR实验。由于2D hCH 和 hNH实验难以区分CH和NH化学位移接近的同类残基(G、V、I)，为了获得13C和15N核的高维MAS NMR，利用3D光谱获得hCCH TOCSY and hNCaH。使用3D NCH和hCCH实验结合GVI同位素标记进行光谱分离，有效的减少了光谱重叠，简化了化学位移分配程序。该研究中使用的模型系统是一个中等大小的蛋白质固态NMR研究，使用这样的3D实验将有利于更大的系统。
结果四：CF合成淀粉样原纤维可通过19F MAS NMR检测
19F核具有众多光谱优势：NMR活跃、敏感性以及100%天然丰富。19F MAS NMR对蛋白质的结构研究主要是在芳香氨基酸侧链上加入氟离子，但大多数脂肪族含氟氨基酸对大肠杆菌是有毒的，不能通过细菌表达有效地整合到蛋白质中。为了研究CF方法是否可以在淀粉样朊病毒原纤维中引入关键19F探针，作者测试了两种掺入定制氟化氨基酸的HET-s折叠体。将亮氨酸掺入氟离子，使用CF合成含HET-s样品(CF-6F-HETs)。相较于常规细菌过表达需要使用大约100mg氟化氨基酸，CF方法只需要用到10mg既可以得到大约1mg蛋白/ml RM，说明CF方法的成本效益非常高。
在CF-6F-HETs(图4a)上60kHz质量下记录的19F实验显示了共振扩展到5ppm的峰值模式。使用MAS结合定制的19F自旋稀释导致了1D实验，其中三个残基的六个C19F3信号中的五个可以被分辨。说明该模式有很好的分辨率。在5,5’-二氟-L-亮氨酸-5,5’-13C水平上实现了13C和19F核的同时掺入(样品称为CF-2F-C-HETs)(图4b)，与纯的5,5’-二氟-L-亮氨酸-5,5’-13C化学位移相比(图4c)，这些位移在更宽的范围内。CF-2F-C-HETS的19F化学位移分散度也远高于19F标记的芳香族氨基酸的蛋白质样品(CF-6F-HETs)。即使通过更快MAS速率结合1H解耦，19F的线宽也被显著改善。
对于CF-6F-HETs样品，19F线宽和观察到的共振数表明样品是高度均匀的，合成的CF样品在19F维度的1D光谱质量是极好的。对CF-2F-C-HETs进行了2D-hCH实验(图4d)，6个信号在该光谱中都可分辨出，说明CF方法对于加入氟化13C标记的甲基残基进行光谱鉴定是有用的。朊病毒感染性试验(图4e)说明氟化的HET-s与体外组装纯化的HET-s原纤维具有相同的感染性。这些结果表明HET-s折叠中氟原子的掺入并不影响其在Podospora anserina中的生物学功能。
图4：CF合成淀粉样原纤维可通过19F MAS NMR检测
结论
研究表明无细胞蛋白表达可以替代传统的细菌表达，产生疏水蛋白，引入NMR活性同位素，提高NMR分析的速度。HET-s(218-289)在无细胞表达混合物中无需变形和纯化直接组装成感染性纤维。通过在氨基酸的关键位置引入定制的13C和15N同位素或CF3和13CH2F标记，CF合成的淀粉样原纤维在亚毫克量下容易接受高分辨率MAS NMR。
图5：不同细胞培养和组装条件下HET-s朊病毒形成结构域的感染性
总结
本文最大的亮点在于使用CF方法代替传统的细胞表达系统合成淀粉样蛋白(HET-s)，该方法不仅简化了合成淀粉样蛋白的流程，而且也保证了HET-s的感染性。通过在氨基酸的关键位置引入定制的13C和15N同位素或CF3和13CH2F标记，使得该淀粉样原纤维在亚毫克量下容易接受高分辨率MAS NMR，并检测到CF合成的淀粉样蛋白的构想与传统的细胞表达系统合成的蛋白构想相似，为进一步表征复杂的原纤维蛋白组装开辟一条道路。
本研究利用CF方法合成出的CF-HET-s，产量为1mg/ml RM，无需后续变形与纯化，不仅降低了结构多态性，而且其生产流程也更经济有效。CF-HET-s表现出与体外重组表达的感染性HET-s一致的结构和生物学特征。通过检测发现CF-HET-s拥有与大肠杆菌(E. coli)表达的HET-s一致的β螺线管结构(图5)。CF-HET-s在局部水平上聚集成稳定的、很明确的淀粉样蛋白结构，从而为我们实现功能性淀粉样蛋白的CF合成提供了一个良好的模型。
在>60kHz的快速MAS条件下，~1 mg的合成产率符合当前固体态NMR分析的要求。通过在CF-HET-s氨基酸的关键位置引入定制的13C和15N同位素，利用MAS 1H检测可以获得高分辨率的2D指纹图谱。此外，3D光谱学也可以应用于CF合成的淀粉样原纤维。通过在CF-HET-s氨基酸的关键位置引入定制的CF3和13CH2F，可用于19F固态NMR进行进一步的结构研究。这些在HET-s模型上展示的方法，允许用定制的氨基酸同位素标记产生淀粉样原纤维，为进一步研究原纤维蛋白组装体的构象提供更多的思路。
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