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助力生物制药行业转型升级 | 无细胞蛋白表达技术在抗体药物研发中的应用

2024-03-07

一、引言

随着生物制药行业的迅猛发展，人们对新型治疗手段和药物的需求日益增加。抗体药物作为生物医药领域中的重要生物制剂，因其具有高度特异性和免疫活性等特点受到了广泛关注。它是一类能够识别和结合抗原的特殊蛋白质，主要通过与靶点抗原结合，介导免疫反应、调理炎症和促进细胞凋亡。其可用于治疗多种疾病，包括肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病和神经性疾病等。然而，由于其生产过程复杂且耗时长，限制了其大规模生产和临床应用。

此外，为了保证抗体药物的安全和有效，需要对其进行质量控制，包括对抗体的纯度、效价和稳定性进行质控。其中，抗体的纯度是关键指标之一，而传统的生产方式无法满足这一需求。因此，寻找一种高效、快速、稳定的抗体药物开发方法变得尤为迫切。无细胞蛋白表达(CFPS)技术应用而生，作为一种新兴的蛋白质合成手段，在解决抗体药物生产问题上展现了巨大的潜力和优势。

二、抗体发现与验证

1.基于传统方法

传统的抗体发现与验证主要有以下几个步骤:

(1)筛选抗原或候选基因序列;

(2)通过PCR扩增这些目标基因;

(3)将编码抗体基因插入载体质粒中,并转染到细胞株中进行表达和扩增;

(4)对表达产物进行纯化分离;

(5)使用ELISA等技术检测其特异性和亲和力是否满足要求。

然而这种方法存在很多局限性，比如：需要大量培养细胞才能获得足够数量的抗体、需要较长时间来开发和验证新抗体、投入的人力财力成本较高、无法实现针对不同靶标快速开发不同种类抗体等问题，因此限制了其在大规模生产中的应用。

图1:传统的抗体发现与验证

2.基于CFPS技术

近年来无细胞蛋白表达技术(CFPS)作为一种新兴蛋白质表达技术，具有以下显著优势:

(1)不需要大量培养细菌/动物，节省了人力、时间、金钱成本，同时也能保证产品质量的稳定性;

(2)可灵活选择不同类型载体，针对不同靶标设计不同载体;

(3)无细胞表达系统通常能够实现高水平的蛋白质表达，因此蛋白质的纯化相对简单;

(4)可高通量生产，实现大规模工业化生产等等。

该技术不仅可以提高蛋白质产量，还可以降低成本，并简化整个流程，从而极大地促进了抗体药物研发和产业化进程。

图2:基于无细胞蛋白表达技术的抗体发现与验证

三、抗体药物的生产

随着生物技术领域的飞速进步和革新，抗体药物这一创新型治疗方案在众多疾病治疗中崭露头角，其展现出的前所未有的巨大治疗潜力正在深刻改变医疗格局。从早期的传统抗体药物，到如今前沿的抗体偶联药物(ADC)与核素偶联抗体药物(RAC)，科研人员不断突破技术壁垒，实现了药物精准靶向和高效传输的新高度。抗体药物的研发与应用正逐步走向精细化、个性化，不仅拓宽了治疗疾病的手段，也预示着未来医学发展的新趋势——针对个体差异制定精准治疗方案。

1.基于传统方法

早期传统抗体药物包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体等，其中单克隆抗体和多克隆抗体需要进行动物实验，制备过程复杂且成本高昂，并且对于人体而言，异种抗体属于异源蛋白，当进入人体后会被免疫系统识别并引发免疫反应，稳定性差且存在批次效应，不易标准化和规模化。而嵌合抗体开发与生产的成本高，制备涉及复杂的基因克隆、重组和细胞培养技术，生产过程中的质量控制、纯化和规模化生产也是面临的挑战，并且存在潜在的免疫原性风险;此外，制备过程中可能会遇到技术难题，如基因重组的效率、细胞转染的稳定性和抗体表达的产量等。

图3：单克隆抗体制备流程

2.基于无细胞蛋白表达技术(CFPS)

CFPS已成为快速生产多种抗体药物的强大方法，包括IgG、单链抗体、Fab和双特异性抗体等，其可使全长抗体能够与原核细胞提取物以高滴度折叠和组装;再加上大肠杆菌的翻译机制相对简单，基于大肠杆菌的体外蛋白质合成反应已成为IgG分子的主要来源。此外，非天然氨基酸在特定位置结合，可用于产生均匀的抗体-药物偶联物(ADC)。Xu, Y., Lee, J., T.等人通过构建以高强度组成型启动子驱动DsbC、FkpA和正交tRNA合成的大肠杆菌，制成无细胞体系后以连续发酵的形式将该菌株提取物用于抗体偶联药物合成，获得了较分批合成更高产量;这将有助于释放CFPS作为生物制药生产平台的潜力。目前无细胞系统已被应用于快速合成各种带有稀有氨基酸(可用于耦合药物或其他功能模块)的免疫球蛋白。

图4：通过无细胞蛋白表达技术促进ADC(抗体偶联)药物生产

365英国上市官方网站新近推出的一款无细胞蛋白表达试剂盒，提供一种制备重组蛋白的方法，能应用于制备全长抗体、制备Fab抗体、抗体高通量筛选等，可轻松进行检测和纯化。

该试剂盒提供的表达系统主要包含：

1、优化的大肠杆菌提取物，增加了DNA转录和翻译过程中结构的稳定性，增加可溶性蛋白的产量;

2、优化的反应缓冲液，通过ATP再生系统持续为蛋白质合成提供能量;

3、优化浓度比例的氨基酸，为蛋白质合成提供充足的底物供应;

4、含GFP基因的优化表达载体，GFP作为阳性对照可以直观观测蛋白表达结果。

四、展望

CFPS可以利用DNA重组技术直接在体外合成目标蛋白质。这种方法不仅可以避免对宿主的依赖性，而且可以大大缩短研发时间和降低成本;同时也能保证产品质量的稳定性，并且可实现大规模工业化生产。相信随着相关研究的不断深入及优化完善，未来CFPS在抗体药物研究上会有更多突破性进展出现!

参考文献：

Yin G, Garces ED, Yang J, et al. Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system. MAbs. 2012;4(2):217-225. doi:10.4161/mabs.4.2.19202.

Xu, Y., Lee, J., Tran, C., Heibeck, T. H., Wang, W. D., Yang, J.,Stafford, R. L., Steiner, A. R., Sato, A. K., Hallam, T. J., & Yin, G.(2014). Production of bispecific antibodies in “knobs‐into‐holes”using a cell‐free expression system. mAbs, 7(1), 231–242.

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Hunt AC, Vögeli B, Hassan AO, et al. A rapid cell-free expression and screening platform for antibody discovery. Nat Commun. 2023;14(1):3897. Published 2023 Jul 3. doi:10.1038/s41467-023-38965-w.

Zhou W, Takeda H. Production of Immunizing Antigen Proteoliposome Using Cell-Free Protein Synthesis System. Methods Mol Biol. 2018;1868:49-67. doi:10.1007/978-1-4939-8802-0_7.

Murakami S, Matsumoto R, Kanamori T. Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system. Sci Rep. 2019;9(1):671. Published 2019 Jan 24. doi:10.1038/s41598-018-36691-8.

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