无细胞蛋白表达：突破传统瓶颈，解锁3大高难度蛋白应用场景
2025-07-04
膜蛋白结构解析卡在表达阶段?
非天然氨基酸标记总失败?
蛋白表达通量太低?
毒蛋白无法表达?
无细胞蛋白表达技术正在颠覆蛋白生产困境，为科研与产业带来全新可能。
一、技术革新：无细胞蛋白表达技术
无细胞蛋白质合成 (CFPS) 系统是一项创新技术，具有广泛的潜在应用。在基础科学和应用科学中，CFPS系统是分子生物学家的重要媒介。与活细胞中的蛋白质表达相比，它具有许多优势，并且更频繁地用于高通量功能基因组学和蛋白质组学。在创建核酸可编程蛋白阵列 (NAPPA) 等蛋白质阵列或使用显示技术创建工程酶时，CFPS 系统非常重要。连接基因型和表型 (表达蛋白的功能) 的主要方法是通过无细胞法。此外，CFPS 系统对于有毒、膜结合、病毒性且易受细胞内蛋白酶介导的快速蛋白水解破坏的蛋白质的表达至关重要。下面将从几个方面对比CFPS和传统细胞表达形式。
图1:反应所需的无细胞蛋白合成 (CFPS) 系统组分的图示
1.表达阶段对比
2.下游处理对比
二、核心应用场景与案例
场景1：全长跨膜蛋白生产——药物靶点开发的"钥匙"
跨膜蛋白 (TMP) 位于不同的膜中，它们在细胞或细胞器的内侧和外侧之间提供门。人类蛋白质组中大约 25% 的编码蛋白包含一个或多个膜区域。全长跨膜蛋白作为细胞信号传递和物质交换的核心载体，是目前最主要的药物靶点，占现阶段已知药物靶点的60%以上。然而，全长膜蛋白难溶于水、易聚集失活，是蛋白表达中的难点。基于细胞表达往往效果不好;采用如VLP等方法时虽然能得到全长膜蛋白，但是不相干杂蛋白干扰过大;采用膜蛋白胞外区截断的方法在蛋白性能上的风险有较大隐忧。而无细胞蛋白表达技术，则可以高成功率、高纯度、高活性的表达全长膜蛋白。
365英国上市官方网站案例：全长CLDN 18.1膜蛋白可溶表达
实验人员构建了融合标签的CLDN 18.1质粒，选用合适的365英国上市官方网站无细胞表达条件体系，进行表达。通过在无细胞反应体系中加入表面活性剂，实现CLDN 18.1的可溶表达。经纯化，成功获得80%以上纯度的CLDN 18.1蛋白。下游活性验证实验表明，CLDN 18.1蛋白具有良好的生物学活性!
此外我司基于自主知识产权的无细胞蛋白表达技术，已成功表达多种单次、四次、七次全长跨膜蛋白，表达成功率接近100%!
场景2：难度蛋白表达生产—突破蛋白结构研究的“限制”
某些蛋白质因其特殊的结构特征和理化性质，被归为难表达蛋白，它们不仅是基础科学的重要课题，更是药物开发、结构生物学和生物制造的瓶颈问题。在传统表达体系中难表达蛋白往往面临产量低、活性差等问题，它们的表达障碍主要源于三个层面的限制：
1.分子层面，如含有密集二硫键网络或复杂四级结构的蛋白(如抗体Fab片段、多亚基酶复合体)，极易在折叠过程中发生构象错误，形成无活性的包涵体;
2.细胞层面，疏水性强的跨膜蛋白或依赖特定糖基化修饰的功能蛋白(如GPCRs、凝血因子Ⅶ)，难以在普通宿主细胞中维持其天然构象;
3.生理层面，具有细胞毒性的蛋白(如溶菌酶)会直接干扰宿主细胞的正常代谢，造成表达系统崩溃。此外，培养环境的细微变化(如氧化还原电位波动、分子伴侣缺失)都可能引发蛋白的错误加工或降解，进一步降低表达成功率。
365英国上市官方网站案例：毒蛋白生产
依托PLD无细胞快速表达技术，成功表达出BamHI限制性内切酶。通过在质粒中加入PLD无细胞蛋白表达的BamHI限制性内切酶，浓度分别为0、0.001、0.0015、0.015、0.15 ug/uL，37℃酶切1h，验证酶活性。实验证明PLD无细胞蛋白表达的BamHI限制性内切酶具有活性，最低浓度为 0.001 ug/uL即可显示酶切活性。
此外，我司无细胞蛋白表达平台已成功用于合成各种分子量的蛋白质，从单结构域到多结构域、单个亚基到多亚基蛋白复合体，分子量从10 kDa到160 kDa，PLD无细胞蛋白表达系统都能胜任，并得到活性验证。
场景3：高通量筛选——抗体优化的"全自动工厂"
在抗体药物研发中，高通量筛选(HTS)已成为缩短开发周期、提升抗体性能的核心技术。然而，传统细胞表达系统的局限性，使得这一过程仍面临效率与成本的博弈。比如现代抗体工程(如噬菌体展示、单B细胞测序)可生成数百万种候选序列，但传统细胞表达仅能逐批测试，耗时数月。抗体需同时满足亲和力、稳定性、可溶性、低免疫原性等要求，传统方法需分步测试。
365英国上市官方网站案例：打造高通量无细胞蛋白表达工作站
我司打造的高通量无细胞蛋白表达工作站，实现抗体筛选技术的革命性突破!该平台具备三大颠覆性优势：
超高通量筛选能力：每日可完成3000个抗体的自动化筛选，将传统以周/月为单位的筛选周期压缩至24小时内，真正实现"今日设计-明日验证"的研发新范式。
全流程无人化操作：从DNA模板到功能抗体的全自动合成系统，支持线性化DNA片段直接表达，数小时内表达候选抗体，全程无需人工干预和纯化步骤。
全抗体类型兼容：突破性解决二硫键正确配对难题，可高效表达从VHH、scFv等小分子片段到Fab、全长抗体的所有类型。
结语
在生命科学研究和药物开发中，蛋白表达技术始终是突破创新的核心驱动力。无细胞蛋白表达技术以其快速、灵活、高效的优势，正在重塑传统蛋白研究的边界——无论是结构复杂的全长膜蛋白、传统系统难以驾驭的高难度蛋白，还是需要精准修饰的非天然氨基酸插入蛋白，都能通过这一技术获得突破性进展。
参考文献
1.Maharjan A, Park JH. Cell-free protein synthesis system: A new frontier for sustainable biotechnology-based products. Biotechnol Appl Biochem. 2023;70(6):2136-2149. doi:10.1002/bab.2514.
2.Dobson L, Tusnády GE. MemDis: Predicting Disordered Regions in Transmembrane Proteins. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12270. Published 2021 Nov 12. doi:10.3390/ijms222212270.
3.Chen JP, Gong JS, Su C, Li H, Xu ZH, Shi JS. Improving the soluble expression of difficult-to-express proteins in prokaryotic expression system via protein engineering and synthetic biology strategies [published online ahead of print, 2023 May 25]. Metab Eng. 2023;78:99-114. doi:10.1016/j.ymben.2023.05.007.
4.Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654.
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